依《周恩来年谱》记载，1967年2月2日，他因长期疲惫不堪突感异常不适，经医生会诊，发现患了冠心病，当即他嘱咐秘书切不可对外说。次日，周恩来身边的工作人员在他办公室的门上贴上大字报，请求他改变现在的工作方式和生活习惯，爱护身体，注意休息。陈毅、聂荣臻、李先念和叶剑英等也都在该大字报上签名支持。2月4日，他在大字报上写下“诚恳接受，要看实践”8个字。邓颖超随后提出五点补充建议。9月24日，他对邓颖超说，我一到早晨8点左右，精神就不行了，手发抖。1970年9月5日，他心脏又出现异常，凌晨开始吸氧，此后办公时都有医护人员在门外守候，随时准备抢救。
1972年5月3日，周恩来在作常规体检时被确诊患上膀胱癌。毛泽东交代这事必须对外保密，认为：“开刀容易扩散，有危险，是否可以通过中医的方法，用中药来控制病情？”还说：“你们外科医生动不动就开刀，开一个死一个，陈老总不是开刀死了吗？谢富治不也是开刀死了吗？”要求“防止扩散，注意营养和休息”。1973年1月13日，周恩来因膀胱癌恶化，排出大量血尿。在泌尿科专家吴阶平主持下，3月10日在玉泉山接受第一次电灼术治疗，术后几天尿色恢复正常。10月，作为癌症病人，他本应接着化疗以巩固效果，可才化疗了两次，中央叫他写出党内10次路线斗争的情况，于是他回到西花厅奋笔疾书，为维护当年安定团结大局不惜委屈自己。11月21日至12月初，根据毛泽东的意见，中共中央政治局由王洪文主持连续召开扩大会议，批评周恩来和叶剑英在11月15日上午同美国国务卿基辛格会谈中所犯错误，说周恩来“丧权辱国”、“投降主义”，成了党内第11次路线斗争执行错误路线的头子，他被迫作了违心的检查。
1974年5月31日，周恩来把当时必须亲自接待的一位外宾送走之后，才于6月1日住进解放军305医院。其间经历了7月和11月两次被批判，加剧了病情，到1976年1月8日逝世，前后共动过大手术6次、小手术8次，平均40天左右动一次手术，除了膀胱癌，结肠癌也乘机发作。
就在这大小手术的间歇期，周恩来除了坚持处理日常国务外，还同中央负责同志谈话161次，同中央有关部门和其他有关方面负责人谈话55次，接见外宾63次，在医院里召开会议20次，还参加了贺龙元帅的骨灰安放仪式、李富春的追悼会和四届全国人大一次会议。
周恩来也作了万一下不了手术台的准备，预定手术的当天，叫来身边工作人员同他一起清理文件。1975年7月1日，他同部分身边的工作人员合影后说，我这是最后一次同你们合影，希望你们以后不要在我脸上打“××”。9月5日17时，他在医院里会见以维尔德茨为首的罗马尼亚党政代表团。考虑到他的体力状况，医生只让交谈20分钟，结果却谈了1小时20分钟。他先对客人说：“医生不让我多说话，所以你说，我听。”当客人问到他的健康状况时，他回答：“马克思的请帖，我已经收到了。这没有什么，这是不以人的主观意志为转移的自然法则。接着感慨：“时间过得真快！还只有10年，就在10年前，我到布加勒斯特去参加乔治乌的葬礼，大衣也没穿，步行走了一个多钟头。现在，我可以告诉你，就连几分钟也走不了了！”他还告诉客人：“现在，第一副总理（邓小平）已经全面负起责任来了！”
后来他尿血，最多时一天达200毫升，无力起床，眼窝和双颊凹陷，瘦得体重只有几十斤，脸色苍白，头发稀疏蓬乱，满脸胡茬。工作人员劝他让长年为其理发的朱殿华师傅来给他理理发，朱师傅也托人捎话说要在1976年的元旦前为他理一次发，干干净净过个年，但他不同意，说：“不，不要了，老朱，他，他看到我这个样子，会，会难过……”极不愿意给人留下痛苦的形象。为此，中共中央政治局作出决定，除邓颖超外，任何亲属都不得进到医院探望，大侄女周秉德也不例外。
周秉德只好打电话给周恩来。在通话中，他反倒做起了侄女的思想工作，要周秉德正确对待生与死。他说，共产党员应该是唯物主义者。人总有那么一天！活了77，还不够吗。天有不测风云嘛！对家人、亲人也要这样，要想得开呀！他还惦记着周秉德的两个儿子，谆谆告诫，不要把他俩养娇了，只有大草原、广阔天地里的花朵，才长得壮，活得好。
1975年9月，周恩来的病情急剧恶化，癌细胞疯狂扩散，免疫力严重下降。20日下午，要动第四次大手术，他要求必须拿来1972年6月23日中共中央在批林整风汇报会上作出的《关于国民党造谣诬蔑登载所谓“伍豪启事”的真相》报告的录音记录稿，躺在手术室的平车上，戴上老花镜，翻看后在首页的标题下侧，郑重地签上自己的名字和日期，并注明“于进入手术室（前），1975年9月20日。”亲自交给邓颖超，才肯被推进手术室。快进手术室了，他又大声说：“我是忠于党、忠于人民的！我不是投降派！”10月24日，他又做了第五次手术，从此再没有下床。邓小平指示医疗组要尽一切努力，“减少痛苦，延长生命”。
据邓颖超的秘书赵炜回忆，1975年11月，刚动完大手术的周恩来点名让她陪邓颖超到医院。一进病房，周恩来便从被子里伸出手：“赵炜，咱俩握握手吧！”握完后轻声地对她说：“你要照顾好大姐（邓颖超）！”赵炜说：“11月15日下午，他让我拿来纸笔，写下了‘我是忠于毛主席、忠于党、忠于人民的，虽然我犯过这样那样的错误，但我决不会当投降派’的字条，由邓大姐代他签上名字和日期。”赵炜还说，早在1975年9月20日做第四次大手术之前，周总理就对邓大姐说了这句话。手术前，邓小平、叶剑英、李先念、张春桥、汪东兴等人都去了，邓大姐就把周总理说的这话转告他们，同时还请汪东兴向毛主席报告，只是没有落实到文字上，才又在11月15日那天专门写了这条子（见《新华月报·天下》2006年2月上半月第99页李菁：《周总理临终嘱托》）。他曾在病床上轻轻哼唱《国际歌》和《三大纪律八项注意》，对邓颖超意味深长地说：“一切都拜托你了！我肚子里有很多很多的话没给你讲！”邓颖超回答说：“我也有很多话没给你讲，只好都带走嘛！”他听了默然无言。
1975年12月后，癌细胞转移引起的疼痛愈来愈厉害，使用麻醉药品和镇静剂都无济于事。一天中午，周恩来叫过工作人员张佐良，问道：“我痛得实在受不了，可不可以让我哼哼几声啊？”张佐良一时哽咽：“总理呀，您愿意怎么样都行，您哼哼吧！”
1975年12月20日凌晨，周恩来醒过来后觉得精神不错。上午测体温38.7℃，于是下午5时叫来罗青长，与之谈论台湾问题达20多分钟。他的声音微弱、断续，罗青长有的听不清，由高振普俯于他的嘴前，听清后再传达。1976年1月2日，周恩来从昏迷中醒来，用微弱的声音和邓颖超一同吟唱《国际歌》。他提出要见老警卫邬吉成，而邬吉成来了后，一直等到第二天凌晨，一直未见要找他的周总理醒来。他为什么在病危之时要见邬吉成，谜底至今未能揭晓。5日凌晨，病危的他做了最后一次手术，医院下达病危通知。7日，以输氧、鼻饲延续生命。邓颖超走后，他不定的眼神好像在寻找什么，问他有什么事，却只摇头；让他休息，也不闭眼；大家猜想他一定在找邓颖超。晚11时，处于弥留状态，医生们为他进行治疗。周恩来微睁双眼，凝视了一下，认出其中有吴阶平医生，声音极度微弱地说：“我，这里，没有什么事了。你，还是，去照顾，别的生病的同志，那里，更需要你。”
1月8日9时57分，周恩来逝世于解放军305医院，终年78岁。他临终留下遗言：骨灰不保留，撒在祖国的大地和江河。希望所有的亲属都留在各自的工作岗位上，不要来北京。工作人员为他理发、刮胡子、刮脸。按照邓颖超的意见，从医院太平间里举行遗体告别仪式起直到火化，他都穿过去喜欢穿的衣服。选购了300多元的骨灰盒，普通得很。决定从飞机上撒放骨灰。1月15日20时左右，治丧办公室副主任罗青长、中共中央组织部长郭玉峰和周总理生前卫士张树迎、高振普一起在缓飞的安-2型农用飞机上，将周恩来的骨灰撒在京、津及山东北部黄河入海口处等地。最后的四把骨灰分别在北京城、密云水库、天津海河入海口以及山东滨州的黄河入海口上空撒放，分别象征他对首都的热爱、对治水的重视、求学和参加革命运动溯源以及对母亲的思念。